• <acronym id="a2m0e"></acronym>
  •  
    資訊中心
    技術文章當前所在位置:首頁 -> 資訊中心 -> 技術文章 -> 詳細信息
    做實驗 | 學會這些酶切技術,告別科研被動996~
    發布時間:2019-04-29 | 瀏覽:2465次 【關閉此頁

           限制性內切酶可以特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。


           在平常酶切實驗中,

           總有一些因素導致結果不理想,

           那么做好酶切應該注意哪些問題呢?

           操作步驟中應注意哪些關鍵因素呢?

           ???


           如何做好酶切實驗?



    一、DNA質量

           ▲DNA的質量是決定酶切效率的最重要的因素。通常在克隆時,如果反復優化酶切條件后,都不能實現完全酶切,最可能的原因就是質粒DNA的質量有問題;


           ▲DNA的質量檢測通常有兩個方法:首先OD260/280比值應該在1.8左右(1.7-1.9),否則意味著DNA樣品中存在大量的蛋白質或RNA污染。其次,瓊脂糖電泳分析時應主要以超螺旋條帶為主,最多不超過三條帶(分別為超螺旋DNA,線性化DNA和環狀DNA),否則意味著質粒DNA的質量不高,應該重新制備。


    二、樣品純度

           DNA中的雜質,如:氯仿、乙醇、SDS等,都會影響酶的活性。

           一般采取以下措施:

           ▲純化DNA;

           ▲加大酶用量;

           ▲延長酶催化反應的保溫時間;

           ▲擴大反應體系(>20ul)。


    三、甲基化影響

           從帶有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制備的DNA,其堿基的一部分已經被甲基化,因此即便使用能夠識別、切斷被甲基化部分的序列的限制酶,也幾乎無法切斷被甲基化的部分。被甲基化的部位,根據底物DNA及宿主種類的不同而不同。例如宿主菌為大腸桿菌的情況下,根據宿主的種類有以下兩種情況:


           在進行轉化時,通常使用C600、HB101、JM109等菌株,因為都帶有dam、dcm甲基化酶,所以使用這些菌株制備的DNA時,必須注意!另外,動物DNA中CG序列多為5mCG,植物DNA中CG及CNG序列多為5mCG和5mCNG。


    四、反應溫度

           大部分酶的反應溫度為37°C,從嗜熱菌中分離出來的內切酶則有更高的要求溫度,一般為50-65°C不等。


    五、DNA分子結構

           DNA分子的不同構型對限制性內切酶的活性有很大影響,某些限制性內切酶在切割超螺旋的質粒時需要的酶量比切割線性DNA時要高很多。


    六、緩沖液

           對于每一種酶都有相應的最佳緩沖液(不同公司的同一種buffer可以互換使用哦~),可保證幾乎100%的酶活性,所以應選擇合適的緩沖液,使用時的緩沖液濃度應為1X。有的酶要求100μg/ml的BSA才可實現最佳活性,在這種情況下,也相應有100X(如NEB公司)或10X(如Takara公司)的BSA,不需要BSA的酶如果加了BSA也不會受太大影響。


    七、反應時間

           ▲對于酶切鑒定試驗(加酶量0.5-1μl,反應體系10-20μl,質粒DNA量在50-200ng),反應時間2-4h(如果時間比較緊的話可以1-2h);

           ▲對于酶切后用于膠回收(加酶量1-2μl,反應體系30-50μl,DNA量在500-2000ng),反應時間3-6h;

           ▲對于反應條件不是很合適的時候(如雙酶切時有一個酶的反應buffer不是很合適或者酶切位點在線性DNA的末端)最長16h。

           ▲為防止Star活性的產生,應將甘油的濃度控制在5%以下,要注意酶的體積不要超過總體積的10%(一般酶都貯存于50%的甘油中)。同時如果酶切時間過長可能會導致基因被切碎。


           DNA酶切出現意外怎么應對?

           不完全酶切或者完全切不開


           ▲可能原因?:內切酶失活

           ▲推薦解決方案:

           1.查看內切酶的有效期;

           2.確保內切酶儲存在-20℃,再低于此溫度,內切酶活性可能受影響;

           3.避免多次凍融(不超過3次),建議使用冰盒儲存或取放內切酶;

           4.勿將酶儲存于無霜冰箱或冰箱開門處:

     

           ▲可能原因?:酶切方案不佳

           ▲推薦解決方案:

           1.按照內切酶供應商推薦的酶切方案及其所適用的DNA樣本類型;

           2.確保酶切反應中包含所需的添加物或酶輔因子(如DTT、Mg2+、ATP、活性腺苷甲硫胺酸);

           3.使用隨酶提供的酶切緩沖液。雙酶切時,按供應商的推薦,需考慮兼容性及其它所需反應條件;

           4.按照供應商推薦的最適酶切溫度進行酶切,雙酶切時若兩種內切酶最適溫度不一致,按順序先進行較低溫度酶切,再進行較高溫度酶切;

           5.確保酶切過程中不會因蒸發而使酶切體積減小,否則會使鹽濃度增高,從而可能降低酶的活性


           ▲可能原因?:內切酶不恰當的稀釋

           ▲推薦解決方案:

           1.避免使用微量體積(<0.5μL)內切酶進行酶切,保證足量日常儲備,確保每個反應所加酶量準確;

           2.勿將內切酶稀釋于水或10×反應緩沖液中;

     

           ▲可能原因?:配制酶切體系不恰當

           ▲推薦解決方案:

           1.在反應體系中最后加入內切酶,加入內切酶后輕彈混勻,確保內切酶不會因甘油密度而沉于管底;

     

           ▲可能原因?:酶切反應混合液中甘油過多

           ▲推薦解決方案:

           1.酶切反應混合液中甘油濃度應<5%,加入內切酶的量不超過總反應體積的1/10,尤其是對于雙酶切;

           2.避免因蒸發而使反應體積減小,從而導致甘油濃度增高;


           ▲可能原因?:酶切DNA濃度不合適

           ▲推薦解決方案:

           1.酶切反應混合液中DNA濃度的最佳范圍為20-100 ng/μL;


           ▲可能原因?:DNA污染

           ▲推薦解決方案:

           1.通過離心柱純化、酚氯仿抽提和乙醇沉淀去除殘留的SDS、EDTA、蛋白、鹽分、核酸酶,用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀,以去除EDTA和鹽分;

           2.當酶切未經純化的PCR產物時,PCR產物體積應不超過酶切總體積的1/3(如30 μL酶切總體積中PCR產物體積不超過10 μL);

           3.如果DNA是經硅膜或樹脂純化,需>10000×g離心10分鐘已去除殘余粒子;

     

           ▲可能原因?:DNA中找不到內切酶識別序列

           ▲推薦解決方案:

           1.重新檢查DNA模板,或通過測序檢查;

           2.如果通過PCR引物引入酶切識別序列,確保引物序列包含酶切識別序列且5’端有4-8個保護堿基;

           3.查看所用內切酶是否需要不止一個識別位點才能發揮完全活性,添加含識別序列的DNA寡核苷酸或亞精胺可提高那些至少需要兩個識別位點內切酶的活性(如AarI、SfiI);

     

           ▲可能原因?:甲基化影響

           ▲推薦解決方案:

           1.查看內切酶的甲基化敏感性。如果內切酶受識別序列甲基化影響,嘗試用異裂酶或同裂酶替代(如MvaI替代EcoRII);

           2.為了避免DNA的甲基化,在dam–/dcm–型大腸桿菌中復制質粒;

           3.如果內切酶需要識別序列甲基化才能發揮功能(如DpnI、SgeI),在dam+/dcm+型大腸桿菌中復制質粒;

     

           ▲可能原因?:DNA結構影響

           ▲推薦解決方案:

           1.對于超螺旋的質粒DNA,其酶切位點可能被包埋,使用經驗證可消化完整質粒的內切酶,如有必要,適當加大酶用量(如每μg DNA 5-10 units酶);

           2.對于線性DNA而酶切位點臨近末端,檢查完全酶切所需的額外堿基;

           3.如果在質粒多克隆位點內進行雙酶切,檢查酶切位點臨近序列,是否具有進行完全酶切所需的堿基數量,如果距離太近,兩種酶切可能會互相影響;

     

           ▲可能原因?:水中有雜質

           ▲推薦解決方案:

           1.將水離心(10 min, 10000×g)以去除水中污染物;

           2.做陰性酶切對照,以水代替酶以檢測水中核酸酶和細菌污染物的影響;

           3.推薦使用新鮮的無核酸酶、分子生物學級別的商品化水;

     

           出現預期外的酶切條帶


           ▲可能原因①:內切酶星號活性

           ▲推薦解決方案:

           1.酶用量不要超過推薦用量,如有必要可適當減少酶用量;

           2.避免過度長時間酶切;

           3.使用推薦的反應緩沖液。低鹽、不合適的PH、除了Mg2+外的二價陽離子可能引起星號活性;

           4.確保酶切反應中甘油濃度不超過5%;

           5.避免因蒸發而使反應體積減小,進而增大甘油濃度和鹽濃度;


           ▲可能原因②:其它內切酶污染

           ▲推薦解決方案:

           1.使用一管新酶或新緩沖液,不恰當的實驗操作可能使內切酶或緩沖液被另一種內切酶污染;

     

           ▲可能原因③:其它DNA污染

           ▲推薦解決方案:

           1.重新制備新的樣本DNA;

     

           出現彌散的DNA條帶


           ▲可能原因?:DNA質量差

           ▲推薦解決方案:

           1.通過電泳檢測未酶切的DNA,如觀察到降解則重新純化DNA;

     

           ▲可能原因?:試劑污染

           ▲推薦解決方案:

           1.如有必要,制備新的試劑,使用新的內切酶或者重新純化DNA,不恰當的操作可能使反應組分被核酸酶污染;

     

           ▲可能原因?:DNA遷移緩慢

           ▲推薦解決方案:

           1.在電泳前加入含0.2% SDS上樣緩沖液后,將酶切DNA在65℃加熱10分鐘,可使與底物DNA仍結合的酶分離;

    標簽:
    上一條:做實驗|一起來找茬——實驗室分析樣品稱量不精準的原因
    下一條:做實驗 | 細胞周期檢測太難太復雜?盤他~
    點擊關閉
    展開
    国产亚洲精品视觉盛宴_国产成人高清亚洲明星一区_亚洲不卡中文字幕无码-美女高潮流白浆娇喘免费网站