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    做實驗 | 細胞周期檢測太難太復雜?盤他~
    發布時間:2019-04-04 | 瀏覽:2205次 【關閉此頁

    細胞量不夠?細胞碎片太多?

    導致實驗一次次重復?盤他!

    教你如何把細胞周期的數據

    變的更加漂亮,準確!


           細胞周期簡介


           流式細胞儀是檢測細胞周期最常用的方法,細胞周期是指細胞分裂結束到下一次細胞分裂結束所經歷的時間,它代表著生命從一代向下一代傳遞的連續過程。


           主要分為以下2大過程:

           ▲分裂間期:間期又分為三期、即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期);

           ▲分裂期M期:細胞分裂期,指細胞分裂開始到結束。


           實驗步驟


           1. 細胞培養:取對數生長期的細胞,按1×106cells/ mL以1mL接種24孔板或2mL接種于6孔板內,進行所需的處理(比如加入藥物),特定時間后終止培養,進行下一步的實驗。

           2. 細胞固定:800rpm離心5min,收集細胞沉淀,棄上清,用預冷PBS洗滌兩次,加入預冷75%乙醇,于4℃固定4h以上。

           3. 細胞染色:800rpm離心5min,棄上清,以3mL的PBS洗滌一次,加入400uL溴化乙錠(PI,50ug/mL),100ulRNaseA(100ug/mL ),4℃避光孵育60min。

           4. 流式分析:以標準程序用流式細胞儀檢測,一般計數2~3萬個細胞,結果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。注:上機前要以50um尼龍網膜或35um細胞過濾器過濾細胞!因為PI具有很強的粘附性,容易使細胞聚團!


           常見問題解答


           1.是否可以直接用乙醇固定細胞?

           不可以,直接70~75%乙醇加入很容易導致細胞聚團現象,很難重懸成單細胞,影響固定效果,甚至容易導致固定后無細胞沉淀的現象。正確做法是:待細胞充分分散成單細胞后,緩慢地滴入無水乙醇中,使其終濃度為70~75%乙醇。


           2.細胞量過少,無法獲得數據結果?

           ▲首先,要保證收集足夠的細胞樣品(個人經驗至少收集100萬左右);如果藥物處理后細胞死亡過多,應該降低藥物濃度;

           ▲其次,固定細胞時先用預冷的PBS重懸細胞,再逐滴滴入無水乙醇中;

    細胞清洗時,不可過度吹打細胞,以防產生過多的細胞碎片;

           ▲最后,盡量采用尖底的離心管和水平的離心機,離心后盡量用移液槍吸走上清,不要傾倒,殘留一點,不要吸完;


           3.什么樣的數據結果可以用?

           ▲G2/M期細胞的DNA含量是G1期的2倍,在直方圖上形成一個2倍于G1信號峰的高斯峰;

           ▲CV(變異系數)表示峰的寬度,CV值越小,峰形越好,最好是在5%左右,一般小于10%也被認可。

           ▲RCS最好是在1~3,高于5則不被認可。RCS高,說明數據的分布和軟件所建立模型的預期值的差別比較大,可能由于處理細胞的時候RNA酶消化不好,或者是PI的濃度不佳造成的。



           4.如何提高分辨率和精確度?

           變異系數(Coefficient of Variation,CV值)反映G0/G1峰分辨率和精確度。而樣品CV值為樣品固有,與樣本制備過程中細胞質量有關。細胞碎片越少、細胞聚團越少、RNA酶消化越充分,可以減少樣本的CV值,提高G0/G1峰分辨率和精確度。


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