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    做實驗 | 細胞凋亡檢測,TUNEL染色錦鯉篇(下)
    發布時間:2019-01-07 | 瀏覽:3077次 【關閉此頁

    <東澳生物實驗結果圖,盜圖必究!>

       TUNEL法是DNA 末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記的方法。這種方法在科學研究中已被廣泛使用。但是由于影響DNA斷裂的因素很多,TUNEL檢測中的操作不恰當可能會引起假陽性或者假陰性的結果,不能體現正確的實驗結果,從取材、組織處理、染色到結果判定,有這些操作細節需要警惕~ 



       6.影響TUNEL染色的一些操作細節


       由于TUNEL操作步驟多,在實驗操作中往往由于細節上的疏忽使實驗失敗??偨Y多年操作經驗,應注意以下問題:


       1)陽性對照

       實驗前應選擇好陽性對照切片。一般試劑公司會提供1-2張陽性對照,如果沒有可以選擇凋亡細胞比較多的有生發中心的淋巴結作為陽性對照。這一點非常重要, 它是評價所有操作過程的準確性和可靠性的陽性標準。

       2)陰性對照

       陰性對照是實驗標本不加TDT進行溫箱孵育, 是控制結果質量的重要參照。

       3)DNA的暴露方法

       由于DNA在細胞核內,必須經過一定的處理才能暴露出來。目前文獻中暴露DNA的方法有多種,如枸櫞酸鹽的微波修復、高壓修復、蛋白酶k的消化等。到底哪種方式好,應該遵照說明書的操作規程來做,因為每個生產商在產品出廠之前會對該產品進行測試,一般來說說明書上所說的暴露方法為最佳方法。我們不能一味最求高陽性率而改變操作方式。當然即使是用說明書上的操作程序有些也是需要操作者來摸索的。例如蛋白酶k的消化時間和濃度,不同的組織以及組織的新舊都會影響其作用效果。

       4)孵育溫度

       有些實驗者往往不在意孵育溫度,其實這也是影響實驗結果的重要因素。室溫不是恒定的,只有保持恒定的條件你的實驗結果才可信,才有可比性和重復性。我們提倡用37℃的溫箱進行孵育,孵育過程中要使用蓋玻片、塑料薄膜或其它能將孵育液蓋住的物質,防止孵育液的揮發。

    <東澳生物實驗室實拍圖,盜圖必究!>


       5)操作中切片的干燥與濕潤

       這在比較早的試劑盒由于顯色方法的單一性不存在這樣的問題。但目前的TUNEL試劑盒大都有兩種顯色方法,即可用熒光顯微鏡觀察,也可用DAB顯色后使用普通的生物顯微鏡觀察。試劑盒往往說這兩種方法都能得到很好的結果。但是我們的經驗告訴我們,如果使用熒光顯微鏡觀察,在滴加TUNEL反應液(TDT液)和標記熒光素抗體的HRP前,必須保持切片干燥,這樣能使熒光素牢固地與TDT結合,熒光強度最佳。如果使用普通的生物顯微鏡觀察則正好相反,實驗中必須保持切片的濕潤,如果在滴加TUNEL反應液(TDT液)和標記熒光素抗體的HRP前切片干燥,會產生嚴重的背景色,影響觀察。因此,實驗者應根據需求采用最佳的方法。


       6)控制顯色時間

       應嚴格觀察陽性和陰性對照組細胞核的顯色時間,一旦陽性對照組細胞核顯現出棕黃色應立即停止,如果陰性對照組有背景顯色,則提示顯色過度,可能出現假陽性結果。高質量的陽性結果是高倍鏡下細胞核被染成棕黃色,而細胞的其他成分不顯色。至于是否對切片進行套染,這并不重要,套染主張用甲基綠或蘇木素。

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       7.TUNEL染色陽性結果的判斷


       這是實驗的最后一步,也是最關鍵的一步。光鏡下凋亡一般累及單個或少數幾個細胞,凋亡細胞呈圓形,HE染色下胞漿紅染,細胞核染色質聚集成團塊狀。由于凋亡細胞迅速被吞噬,又無炎癥反應,因此,在常規切片檢查時,一般不易發現,但在某些組織如反應性增生的次級淋巴濾泡生發中心則易見到。TUNEL染色下凋亡細胞核為棕黃色,單個細胞或散在存在,多存在于壞死與正常組織的交界處,在壞死的組織中凋亡細胞反而少見。背景為無色或復染后的綠色或藍紫色。

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